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          分享一下关于质粒的分离操作方法
          浏览次数:118发布日期:2020-05-08
            今天跟大家分享一下关于质粒的分离操作方法,下面让我们一起来了解一下吧。
           
            从细菌中分离质粒 DNA 的具体操作
           
            材料设备试剂
           
            一、材料
           
            含PBS的E.coliDH5α或JM系列菌株,1.5ml塑料离心管(又称eppendorf管)千亿体育,离心管架。
           
            二、设备
           
            微量取液器(20μl,200μl,1000μl),台式高速离心机,恒温振荡摇床,高压蒸汽消毒器(灭菌锅),涡旋振荡器千亿体育,电泳仪,琼脂糖平板电泳装置和恒温水浴锅等。
           
            三、试剂
           
            1、LB液体培养基(Luria-Bertani):称取蛋白胨(Tryptone)10g,酵母提取物(Yeastextract)5g,NaCl10g,溶于800ml去离子水中,用NaOH调pH至7.5,加去离子水至总体积1升,高压下蒸气灭菌20分钟。
           
            2、LB固体培养基:液体培养基中每升加12g琼脂粉,高压灭菌千亿体育。
           
            3千亿体育、氨苄青霉素(Ampicillin,Amp)母液:配成50mg/ml水溶液,-20℃保存备用。
           
            4千亿体育千亿体育、溶菌酶溶液:用10mmol/LTris·Cl(pH8.0)溶液配制成10mg/ml千亿体育,并分装成小份(如1.5ml)保存于-20℃,每一小份一经使用后便予丢弃。
           
            5、3mol/lNaAc(pH5.2):50ml水中溶解40.81gNaAc·3H2O,用冰醋酸调pH至5.2,加水定容至100ml千亿体育,分装后高压灭菌,储存于4℃冰箱。
           
            6、溶液1:50mmol/L葡萄糖,25mmol/ L T r i s. Cl(pH8.0)千亿体育,10mmol/LEDTA(pH8.0)。溶液Ⅰ可成批配制,每瓶100ml,高压灭菌15分钟千亿体育,储存于4℃冰箱。
           
            7、溶液Ⅱ:0.2mol/LNaOH(临用前用10mol/LNaOH母液稀释),1%SDS。
           
            8、溶液Ⅲ:5mol/LKAc60ml,冰醋酸11.5ml,H2O28.5ml,定容至100ml,并高压灭菌。溶液终浓度为:K+3mol/L,Acˉ5mol/L。
           
            9、RNA酶A母液:将RNA酶A溶于10mmol/LTris·Cl(pH7.5),15mmol/LNaCl中,配成10mg/ml的溶液,于100℃加热15分钟,使混有的DNA酶失活。冷却后用1.5mleppendorf管分装成小份保存于-20℃。
           
            10千亿体育、饱和酚:市售酚中含有醌等氧化物,这些产物可引起磷酸二酯键的断裂及导致RNA和DNA的交联,应在160℃用冷凝管进行重蒸千亿体育。重蒸酚加入0.1%的8-羟基喹啉(作为抗氧化剂),并用等体积的0.5mol/LTris·Cl(pH8.0)和0.1mol/LTris·Cl(pH8.0)缓冲液反复抽提使之饱和并使其pH值达到7.6以上,因为酸性条件下DNA会分配于有机相。
           
            11、氯仿:按氯仿:异戊醇=24:1体积比加入异戊醇。氯仿可使蛋白变性并有助于液相与有机相的分开,异戊醇则可起消除抽提过程中出现的泡沫。按体积/体积=1:1混合上述饱和酚与氯仿即得酚/氯仿(1:1)千亿体育。酚和氯仿均有很强的腐蚀性,操作时应戴手套。
           
            12、TE缓冲液:10mmo/LTris·Cl(pH8.0),1mmol/LEDTA(pH8.0)。高压灭菌后储存于4℃冰箱中。
           
            13、STET:0.1mol/LNaCl,10mmol/LTris·Cl(pH8.0),10mmol/LEDTA(pH8.0)千亿体育,5%TritonX-100。
           
            14千亿体育、STE:0.1mol/LNaCl千亿体育,10mmol/LTris·Cl(pH8.0),1mmol/LEDTA(pH8.0)。
           
            15、电泳所用试剂:⑴TBE缓冲液(5×):称取Tris54g,硼酸27.5g千亿体育,并加入0.5MEDTA(pH8.0)20ml,定溶至1000ml。⑵上样缓冲液(6×):0.25%溴酚蓝,40%(w/v)蔗糖水溶液。
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